21 / 3 / 226 هجلت جبهعت تكريت للعلوم السراعيت ISSN1813166 تحديد الكممات الدالة: الباميا البعد الو ارثي لمم ارسمة: عمار هاشم سعيد جامعة تكريت / كمية الز ارعة / قسم عموم البستنة البعد الو ارثي ألصناف مختمفة من الباميا(. L (Abelmoschus esculentus باستخدام مؤش ارت RAPD عمار هاشم سعيد ماجد خميف الكمر عقيل حسين العاصي قسم البستنة / كمية الز ارعة قسم البستنة / كمية الز ارعة والغابات قسم عموم الحياة/ كمية العموم الخالصة جامعة تكريت جامعة الموصل جامعة تكريت أجريت ىذه الد ارسة في أثناء الموسم الز ارعي 3123/3122 في حقل أبحاث الخضر/ قسم البستنة وىندسة الحدائق/كمية الز ارعة والغابات/جامعة الموصل, بيدف د ارسة القرب والبعد الو ارثي باستخدام المؤش ارت الجزيئية في نبات الباميا ( esculentus Abelmoschus Clemson spineless )( Cleson )3( Clemson spineless )2( استخدمت في الد ارسة) 8 ( أصناف من مناشئ مختمفة ىي:.L(. )5( 8 Samara )( Sultani )6( موصمية )8( بت ارء, وأدخمت في تيجينات تبادلية, Diallels Cross استخدمت 3 بادئا عشوائيا في مؤش ارتالRAPD إال أن 2 منيا فقط أنتجت 26 حزمة وكانت الحزم الناتجة جميعيا متباينة الموقع Polymorphic bands واعتمدت 2 2 نتائجيا لتحميل التنوع الو ارثي لمنماذج المدروسة من نبات الباميا, ومن بين ال بادئ ىناك بادئا تمكن من تحديد بصمة الDNAلثالثة عشر تركيبا و ارثيا وزعت عمى )( آباء ىي Cleson و Sultaniو موصمية, و ):( ىجائن ىي )2 3( و )2 5( و )2 6( و )2 ( و) 5 3 ( و ) 5( و ) ( و )6 ( و ) 8(, كما أظيرت مؤش ارت الRAPD أن أقل بعد و ارثي كان بين اليجينين )8 3( و ) 5 (بمغ )1.28(, أما اكبر بعد و ارثي كان بين االب )6( واليجين )8 ( بمغ) 1.:8 ( وت اروحت بقية التر اكيب الو ارثية بين ىذا المدى. أما تحميل العالقة الو ارثية فقد اظير وجودخمس مجموعات رئيسة ضمتالمجموعة األولى اآلباء )2 و 3 و و 5 و و 8( واليجائن )2 3 و 2 و 2 5 و 2 6 و 2 و 2 8 و 3 و 5 3 و 6 3 ( وضمت المجموعة الثانية االب )6( فقط وضمت الثالثة اليجائن )3 و 3 8 و 5 و 6 و 5 6 و 5 و 5 8 و 6 8 و 8 ) وضمت المجموعة ال اربعة اليجائن ) و 8 و.) 6 Estimating genetic distance to variety of okra (Abelmoschus esculentus L.) by rapd marker Ammar Hashim Saied Majd Khleef ALKummer Akeel Hussein ALAsie College of Agriculture College of Agriculture and Forestry College of Science University of Tikrit University of Mosul University of Tikrit KeyWords: Okra, variety Correspondence: Ammar Hashim Saied University of Tikrit College of Agriculture Abstract This study was carried out during the growing seasons (211/212) at Vegetative Research Field, Department of Horticulture and Landscape design, College of Agriculture and Forestry, Mosul University. The objectives of this research was to study: the architecture of qualitative and quantitative traits of yield in okra plant ; combining ability, heterosis and correlation between the traits of the parents and first. Seven genetics line okra were used in this study namely (1 Clemson spineless, 2Cleson, 3Clemson spineless 8, Sultani, 5Samara, 6Moslly and Batra). These genotypes were crossed in all possible combinations (Full Diallel Cross). The seeds of seven parents and their first including reciprocals were sown using Randomized Complete Block Design with three replications. The following traits were studies : estimate the molecular markers (fingerprint) of the parents and their first including reciprocal, at the laboratories of the molecular biology/department of biology/college of Sciences/Tikrit University. The results can be summarized as follows :Genomic DNA from 1.5 2g of fresh tissue was isolated, a range yields were in the range of 35μL. DNA polymorphisms were scored within amplified bands on either agarose gels or electrophoresis according to DNA marker type. Data were further analysis further using the NTSYSPC software to determine Genetic Distance (GD) and Genetic Relationship (GR) among barley varieties. The overall results obtained are as follows : In the RAPD experiments, 28 different primers were tested, only 2 primers produced amplified bands and the total number of these bands were 135.All them polymorphic bands. Only thirteen line were fingerprinted namely Local parents Cleson, Sultani, Moslly and Hybrid (1x2), (1x), (1x5), (1x6), (2x), (3x), (3x6), (5x6), (3x), The lowest (.13) GD calculated was found between (x2) and (6x) and the highest (.3) GD was found between (5) and (x3). RAPD based markers molecular dendrogram (DG) showed two group clusters, the first included (6) parent and hybrid(1x2),(1x3),(1x), (1x5), (1x6), (1x), (2x3), (2x), (2x5),the second included parent (5) the three groupincluded hybrid (2x6), (2x), (3x), (3x5), (x6), (x5), (6x), (5x), (x), and the four clusters included (3x6),(3x),(5x6). ** البحث مستل من اطروحة دكتو اره لمباحث االول.
هجلت جبهعت تكريت للعلوم السراعيت ISSN1813166 21 / 3 / 226 المقدمة تعد البامياL.(Okra )Abelmoschus esculentus من محاصيل الخضر الصيفية الشائعة وىي تعود إلى العائمة الخبازية Malvaceae,يعتقد أن موطنيا األصمي المناطق التي تضم الحبشة واريتريا والسودان ومصر, وىي من النباتات الذاتية التمقيح )مطموب وآخرون, :2:(, ونبات الباميا من الخض اروات ذات القيمة الغذائية العالية وىي غنية بالعناصر الغذائية, إذ يضم كل 211 غم من الثمار الخض ارء الصالحة لؤلكل 21.5 غم مادة جافة و 2 سعرة ح ارريةو 1: ممغم كالسيوم و 2 ممغم حديد و 21 ممغم كاروتين و 8. كاربوىيد ارت و 1. زيوت و 1.162 فسفور, و 2, غم بروتين, 1.18 غم ثيامين, 1.1 غم اريبوفالفين, 1. غم نياسين, 2.1 غم فيتامين C وتزرع الباميا لتؤكل ثمارىا وقد تجفف أو تجمد وتؤكل مطبوخة مع بعض الخض اروات وخاصة الطماطة وىي الشائعة في الع ارق كما قد يستعمل مسحوق الثمار إلضافة النكية إلى األطعمة )مطموب وآخرون :2: ), وبمغت المساحة المزروعة في الع ارق )6,:2( الف ىكتار وبمغت اإلنتاجية )8855( كغم/ىكتار, أما اإلنتاج الكمي فقد بمغ )262( الف طن )المنظمة العربية لمتنمية الز ارعية, 3122(. تستخدم تقنية المضخم العشوائي Random )RAPD( Amplified Polymorphic DNA لتوضيح العالقات الو ارثية بين الصفات لممحاصيل المختمفة, وت ظير ىذه العالمات الو ارثية قيما عظمى وموثوقا بيا وأن إمكانية الحصول عمى ىذه العالقات الو ارثية بوساطة ىذه التقنية تتميز بالسرعة الكبيرة, وأن التصنيف الو ارثي الجزيئي لمت اركيب الو ارثية يتفوق عمى تركيب الشكل الظاىري, فالو ارثة الجزيئية ال تتأثر بالظروف البيئية, ويمكن أن تستعمل لمتمييز بين الت اركيب الو ارثية في الباميا واالرتباط بين ىذه الت اركيب) Aladele وآخرون, 311 (. ان معرفة التنوع والعالقات الو ارثية بين أصناف الباميا يمعبان دو ار ميما في ب ارمج التربية لمنبات ومن خالل وجود ت اركيب و ارثية عديدة من الباميا فقد اعتبرت ىذه الت اركيب قاعدة و ارثية كبيرة ي ستند عمييا لتقييم النبات من خالل اختالف التنوع الو ارثي ليذه الت اركيب, ولقد كان قياس التمثيل والتنوع الو ارثي ىدفا رئيسا في عموم الحياة التطورية وبما ان اختالف الت اركيب الو ارثية لنبات الباميا يختمف معو المظير الخارجي لمنبات لذا فان تقييم ىذه الصفات يتطمب وصول النبات لمرحمة النضج الكامل حتى يتم التحقق من ىذه الصفات الخاصة بالتركيب الو ارثي, ولقد اختصرت تقنية الو ارثة الجزيئية ىذه الفترة واثبتت ىذه التقنية بأنيا أداة قوية في تقييم األداء الو ارثي لمنبات وتوضيح العالقات الو ارثية ضمن وبين النوع الواحد Aladele( وآخرون,311(. استخدم Aladele وآخرون )311( تقنية ال RAPD لد ارسة العالقة الو ارثية ل : تركيب و ارثي من الباميا, 61 تركيب و ارثي إفريقي و 5 تركيب و ارثي آسيوي حيث أوضح التحميل الجزيئي ان جميع البادئات الثالثة عشر المستخدمة أظيرت تنوع أكثر في الت اركيب الو ارثية لمباميا األسيوية من األفريقية وأشارت الد ارسة ان ىذا التنوع يشير ان ىذه الت اركيب جمعت من ست مناطق مختمفة, ويوضح Saifullah وآخرون )3121( في د ارسة تقييم التنوع الو ارثي ل 232 تركيبا و ارثيا في الباميا باستخدام مؤش ارت ال RAPD ان البادئات العشوائية المستخدمة اعطت حزمة مختمفة, وأشار مخطط الdendrogram لمحزم الناتجة إلى وجود مجاميع طبقا لتنوع ىذه الت اركيب كما ان تقنية التحميل الو ارثي كانت مشابية لما موجود بالطرز المظيرية, وأشارت الد ارسة إلى وجود قاعدة و ارثية عالية لمتنوع الو ارثي يمكن ان تستغل في ب ارمج التربية, ويضيف Kumar و Ananthanarayanan والبصمة الو ارثية لمؤش ارت ال تطبيق تقنية ال )3121( في د ارسة التقنية الحيوية DNA في الباميا من خالل RAPD PCR لتوضيح التشابو بين 5 تركيبا و ارثيا وباستخدام 1 بادئا عشوائيا, تبين من خالليا ان بادئات اعطت polymorphism وتضخيم جيد لحزم ال,DNA كما أعطى البادئ OPF 1 قدرة تمييزية أعمى بينما أعطى البادئ OPG 1 قدرة تمييزية أوطأ, وبينت نتائج الد ارسة ان المخطط العنقودي كشف وجود عالقة ارتباط بين الت اركيب الو ارثية ال 5 من خالل تقسيميا إلى مجموعتين رئيسيتين. وفي د ارسة أج ارىا Nwangburuka وآخرون )3122( حول التوصيف الجزيئي لتسعة وعشرون تركيب و ارثي من الباميا باستخدام تقانة RAPD تبين من خالليا وجود Polymorphism بنسبة 2,5, كما وضحت الد ارسة ان البادئ OPX 1 كان األكثر من بين البادئات المستخدمة في تعدد أشكال الحزم إذ اختمف في حزم من بين 23 حزمة وأظير polymorphismبنسبة 8 بينما أعطى البادئ )( OPY2 حزم متعددة الشكل من بين )( حزم منتجة وبنسبة polymorphism قدرىا 86 كما قد كشفت الد ارسة من خالل المخطط العنقودي وجود خمس مجاميع رئيسية وان التركيبين المتباعدان جدا يبينان ان أصميما الو ارثي متنوع إلى حد كبير, واستنتج Prakash وآخرون )3122( في د ارسة العالقة الو ارثية بين 55 تركيب و ارثي من نبات الباميا باستخدام 25 بادئ بواسطة تقنية ال RAPD بأن جميع البادئات أظيرت اختالف واضح بين الت اركيب الو ارثية من خالل الحزم الناتجة
مº مº هجلت جبهعت تكريت للعلوم السراعيت ISSN1813166 21 / 3 / 226 بالتحميل الجزيئي, كما كشفت الد ارسة أن البادئ أعطى OPD5 21 حزم مختمفة من بين 22 polymorphism لجميع البادئات كانت :,1: وان نسبة ال حزمة أنتجيا ونسبة polymorphism, 85,1 و اظير المخطط العنقودي لمتحميل الجزيئي وجود مجموعتين رئيسيتين و تحت كل مجموعة تم توصيف الصفات الخاصة بالبنية الو ارثية والشكل الظاىري لؤلصناف المختمفة.تم تنفيذ ىذه الد ارسة التعرف عمى بيدف البعد الو ارثي بين الت اركيب الو ارثية والعالقة بين األصناف وىجنيا التبادلية باستخدام تقنية المؤش ارت الجزيئية Molecular. Marker المواد وط ارئق العمل : نفذت الد ارسة في الحقل التابع لقسم البستنة وىندسة الحدائق كمية الز ارعة والغابات/ جامعة الموصل خالل الموسم الز ارعي الربيعي )3122( وتضمن ز ارعة بذور لسبعة أصناف من الباميا ا عطيت األرقام من )82( بتاريخ مروز طول كل مرز م ولكل صنف 3122/5/6 عمى 5 مروز, وكانت المسافة بين مرز وآخر 86 سم و المسافة بين جوره وأخرى 61 سم, وبواقع 23 جوره في كل مرز, وعند وصول النباتات لمرحمة التزىير اجريت عممية التيجين التبادلي بين االصناف المستخدمة في البحثوذلك في بداية الشير السادس )حزي ارن( حيث أجريت عممية إ ازلة المتوك ألزىار الباميا )األميات( في المساء قبل تفتح األزىار بفترة )2523( ساعة, الن تفتح األزىار يكون صباحا وتكون المياسم جاىزة لمتمقيح ب )( ساعات قبل تفتح الزىرة )فندري 2: و المحمد وآخرون,311(, وذلك من خالل فتح األو ارق الكأسية و إ ازلة األو ارق التويجية بشفرة دون التأثير في األنبوبة السداتية بعدىا قشطت األنبوبة السداتية المتكونة من خمسة اسدية ممتحمة التي تحيط بالقمم, حيث تكون المتوك وقتيا غير متفتحة وجالسة عمى األنبوبة السداتية, بعد ذلك أعيدت األو ارق الكأسية لحالتيا الطبيعية ووضع كيس عمى الزىرة لمعرفة الزىرة التي ا زيمت منيا األعضاء الذكرية. وعند صباح اليوم التالي قطعت األزىار التي استخدمت لغرض الحصول عمى حبوب المقاح منيا, ونثرت حبوب المقاح عمى ميسم الزىرة المستخدمة كأم من خالل دعك األنبوبة السداتية, ثم وضعت بطاقة عمى الزىرة الممقحة تحمل رقم الصنف المستخدم كأب و تأريخ التيجين, بعدىا تم إعادة التكييس ثانيا, وبعد مرور يوم أو يومين عمى التمقيح )التيجين( تم رفع الكيس من فوق الزىرة, وحين وصول الثمار لمرحمة النضج التام لمبذور وىي مرحمة تيبس الثمار عمى النبات, قطفت مع بطاقة معمومات التيجين المثبتة عمييا ووضعت في أكياس ورقية و استخرجت بذورىا, وفي الموسم التالي 3123 تم ز ارعة بذور االباء واليجن الناتجة منيا وفق تصميم القطاعات العشوائية الكاممة مكر ارت. R.C.B.D تم عزل الDNAوفقا لما ذكره Weigand( بواقع ثالث وآخرون,::2( المعتمدة عمى طريقة ) SahgaiMaroofوآخرون, 2:5 (باخذوزن 1.6 2 غممن األو ارق الفتية حيث وضعت في صحن خزفي واضيف الييا النتروجين السائل وتم سحق أج ازء الورقة ثم نقل المسحوق إلى أنابيب زجاجية معقمة وأ ضيف الييا مباشرة مل من محمول االستخالص CTAB الذي تم اخذه مباشرة من الحمام المائي بدرجة 6 ثم تقمب االنبوبة لحين تجانس الخميط و تترك لمتحضين في الحمام المائي عمى درجة º6 م ولمدة من 1 1: دقيقة, واستخدم في استخالص ال DNA المحمول المتكون من المواد و موالرNaCl 2.5 211 ممي موالرTrisHCl 31 و موالرEDTA Na 2 و 3 ممي CTAB و 1.6 موالر كموكوز Maniatis( وآخرون, 2:3( و محمول كموروفورم كحول آيزوأميمي )35;2( و محمول الغسل و محمول تذويب ال.DNATE buffer ر فعت بعدىا األنابيب من الحمام المائي, بعدىا تم إضافة محمول كموروفورم : كحول ايزواميمي )35;2( مع رج األنابيب بيدوء لمدة 3126 دقيقة, تم وضع األنابيب بعد التحريك في جياز الطرد المركزي ونبذت عمى سرعة 5 دورة/ دقيقة لمدة 26 دقيقة وعمى ح اررة º5 م, وبعد انتياء عممية النبذ سحبت من األنابيب الطبقة المائية ال ارئقة العميا بواسطة ماصة دقيقة Micropipette وتم إعادة مرحمة النبذ نفسيا وتحت نفس الظروف أعاله, سحبت الطبقة المائية بواسطة الماصة إلى أنابيب جديدة معقمة بعد انتياء النبذ واضيف ليا حجم مماثل من كحول ايزوبروبانول المبرد لكل عينة بعدىا تم تقميب األنابيب بيدوء لمزج الكحول بالعينة بشكل جيد, في ىذه األثناء تتكون كتمة بيضاء ىي عبارة عن خيوط ال, DNA تم رفع ىذه الكتمة إلى أنبوب آخر يحتوي عمى 6 مل من محمول الغسل, تبقى خيوط الDNA مدة 31 1 الDNA كمية 11 دقيقة في محمول الغسل, بعدىا يتم رفع خيوط من محمول الغسل إلى أنابيب جديدة تحتوي عمى 511 مايكروليتر من محمول اإلذابة TE Buffer وتترك الخيوط إلى أن تذوب بشكل كامل ثم تحفظ العينات الستخداميا الحقا. Stock sample حضر ىالم األكاروز بتركيز عمى درجة ح اررة 31 بإضافة 1, 2,3 غم من االكاروز إلى 261 مل من X 2 TBE ووضع في جياز الترحيل الكيربائي وتم توصيل أقطاب التيار الكيربائي بوضع القطب السالب من جية الحفر والقطب الموجب من الجية الثانية لكي تتم حركة عينة الDNA من القطب السالب إلى
هجلت جبهعت تكريت للعلوم السراعيت ISSN1813166 21 / 3 / 226 الموجب بعدىا يتم إيقاف الترحيل عند وصول الصبغة الزرقاء إلى ما قبل نياية اليالم. يرفع الموح مع اليالم ويوضع في حوض يحتوي عمى لتر من محمول صبغة بروميد االيثيديوم التي تم تحضيرىا مسبقا و يترك لمدة نصف ساعة مع تحريك مستمر وىادئ. يتم فحص اليالم بوضعو عمى جياز األشعة فوق البنفسجية وعند طول موجي 31 نانوميتر لرؤية حزم ال. DNA تم إج ارء تفاعالت ال RAPD باالستناد إلى Williamsوآخرون (1::2( عمى عينات DNA واستخدم ال Kit المجيز من قبل شركة Bioneer وجيزت. الكورية البادئات العشوائية من قبل شركة Operon Technologies, U.S.A وكما مبينة في الجدول )2(. تم ضبط تركيز ال DNA لجميع العينات بواسطة محمول TE لغرض الحصول عمى التركيز المطموب إلج ارء تفاعالت ال RAPD ويكون بحدود) 6151 ( نانوغ ارم/مايكروليتر لكل عينة, تم إضافة Eppendorff tube لكل 2,6 مايكروليتر ماء مقطر و آخر مرحمة يضاف مكونات أنبوبة أدخمت المحتوي عمى مكونات التفاعل 1,6 2 مايكروليتر من ال مايكروليترPrimer DNA 31 Eppendorff tube و لتكتمل مايكروليتر, و األنابيب الحاوية عمى خميط التفاعل والعينات إلى جياز المبممر الح ارري Thermo cycler Reaction إلج ارء تفاعل التضاعف وطبق البرنامج المناسب لمتضاعف وعمى جميع التفاعالت لكل العينات وتم تنفيذ البرنامج كما يمي : 2 الجدول رقم )1( البادئات المجهزة من شركة OPERON مع تتابعاتها. تتابعو البادئ ت تتابعو البادئ ت 5' TGGTGGACCA 3' OPL2 25 5' AGGTGACCGT 3' OPA18 2 5' TCTGTTCCCC 3' OPM8 26 5' CAAACGTCGG 3' OPA1 3 5' AGGTCTTGGG 3' OPM2 2 5' GGTCCCTGAC 3' OPA6 5' CAGCCCAGAG 3' OPN 28 5' TCCGCTCTGG 3' OPB1 5 5' AAGCGACCTG 3' OPN16 2 5' GATGACCGCC 3' OPC5 6 5' GTGGTCCGCA 3' OPP 2: 5' ACCCGGTCAC 3' OPD2 5' TCCCGCCTAC 3' OPP1 31 5' CACCAGGTGA 3' OPE1 8 5' GGGACGATGG 3' OPQ1 32 5' GGTGACTGTG 3' OPE16 5' GAGCGCCTTG 3' OPQ6 33 5' GGTCGGAGAA 3' OPH1 : 5' GAAGCCCTTG 3' OPQ1 3 5' GGAGGAGAGG 3' OPI2 21 5' TCGCCCAGTC 3' OPQ2 35 5' AGAGGGCACA 3' OPI12 22 5' GTCTACGGCA 3' OPR6 36 5' CCACACTACC 3' OPJ13 23 5' AGATCCCGCC 3' OPV1 3 5' ACGCCAGTTC 3' OPJ1 2 دورة واحدة تستمر )5( دقائق عمى درجة ح اررة لممسخ األولي لشريط ال DNA º 5: م. 3 درجة ح اررة ح اررة بدرجة ح اررة )51( دورة تضاعف كل دورة تستمر )1( ثانية عمى º 3: م لمسخ الشريط المزدوج و )56( ثانية بدرجة º م الرتباط البادئ بال DNA و )56( ثانية أخرى º 83 م الستطالة البادئ. آخر دورة تبقى لمدة )8( دقائق وعمى درجة ح اررة º 83 م الستكمال مرحمة االستطالة. 5 بعد انتياء م ارحل التفاعل ترفع األنابيب من جياز المبممر الح ارري و يسحب منيا )6( مايكروليتر وتحمل العينات في حفر ىالم االكاروز الذي تم تحضيره سابقا مع ال 2,3 بتركيز Marker الحجم الجزيئي, ثم المعموم ت رحل العينات في جياز الترحيل, وبعد انتياء الوقت يصبغ اليالم بغمره بصبغة بروميد االثيديوم لمدة دقيقة مع 1 التحريك ثم تعريضو لمصدر لؤلشعة فوق البنفسجية لغرض تصوير اليالم. قدرت الكفاءة لكل بادئ باستخدام المعادلة) Grudman وآخرون, :)2::6 الكفاءة = )عدد الحزم المتباينة لكل بادئ \العدد الكمي لحزم التضاعف لكل بادئ ( 211 و القدرة التمييزية تم إيجادىا اعتمادا عمى المعادلة التالية: القدرة التمييزية=)عدد الحزم المتباينة لكل بادئ\ العدد الكمي لمحزم المتباينة لجميع البادئات( 211 يتم تحويل النتائج التي نحصل عمييا والتي تظير في اليالم إلى جداول التوصيف وذلك بوضع )2( عند وجود الحزمة و )1( عند غياب الحزمة األصناف )اآلباء( واألجيال المنتجة بغية إيجاد العالقة الو ارثية بين ويتم تحويل بيانات التوصيف إلى قيم التشابو )Similarity( المقدرة باستخدام الحاسوب ضمن برنامج )SIMQUL( Similarity for ( Lei و Nei والذي يعتمد عمى معادلة )qualitative data :)2:83( Similarity=2nxy/nx+ny
هجلت جبهعت تكريت للعلوم السراعيت ISSN1813166 21 / 3 / 226 تقدير النسبة المئوية لمبعد الو ارثي distance( )Genetic بين اآلباء واألجيال والتي تعتمد عمى نتائج التشابو الو ارثي وفقا لممعادلة التالية Nei( و, Lei )2:8: : حيث إن : = عدد nxy y و xالحزم المشتركة بين النموذجين االباء والجيل التالي x الحزم الكمية في النموذج =عدد nx y عدد الحزم الكمية في النموذج = ny يعتمد مخطط التحميل التجميعي عمى قيم األبعاد الو ارثية التي يتم الحصول عمييا من الخطوة السابقة وذلك وفقا لطريقة UPMA cluster analysis حيث يتم إدخال ىذه القيم في الحاسوب اآللي ضمن برنامج PC( )NTSYS وبالتالي الحصول عمى مخطط التحميل التجميعي الذي يوضح المجاميع الو ارثية القريبة والبعيدة من بعضيا البعض ولجميع الت اركيب الو ارثية Rohlf(, ::2(. النتائج والمناقشة يتضح من نواتج تفاعالت ال RAPD المطبقة عمى الت اركيب الو ارثية لمباميا ان البادئات قسمت كما يمي : المجموعة األولى : وىي البادئات التي لم تظير أي ناتج تضاعف لحزم ال DNA عمى ىالم األكاروز وبمغ عددىا )( بادئات عشوائية: OPC5, OPB1, OPJ1, OPP1, OPA6, OPQ1, OPN16, OPM2, وشكمت نسبة 1,8 من مجموع البادئات المستخدمة, وتكمن أىمية البادئات التي لم تظير حزم تضاعف في ىذه الد ارسة في كونيا مفتاح ليذه الت اركيب الو ارثية, بحيث أن أي تركيب و ارثي يظير حزم تضاعف باستخدام ىذه البادئات يكون خارج الت اركيب الو ارثية الداخمة في ىذه الد ارسة. المجموعة الثانية : تضمنت ىذه المجموعة )2( بادئا وجدت لتتابعاتيا مواقع مكممة عمى ال DNA المجيني لآلباء واليجائن التبادلية المدروسة لنبات الباميا وكون ىذا العدد من البادئات نسبة 35,: من مجموعة البادئات الكمية التي ادخمت في تفاعالت ال RAPD,و قد أنتجت ىذه البادئات عددا من الحزم بمغ مجموعيا 26 حزمة وبمعدل 8,6 حزمة لكل بادئ. إن ناتج ىذه البادئات قد اختمف من حيث العدد والوزن الجزيئي لمحزم الناتجة من بادئ إلى آخر ويعمل سبب ىذا االختالف إلى تباين الت اركيب الو ارثية فيما بينيا. البادئات ذات الحزم المتباينة بالعدد والموقع Polymorphic bands وىي البادئات التي أنتجت حزما متباينة بالعدد والوزن الجزيئي بين الت اركيب الو ارثية لآلباء واليجائن التبادلية بعد ترحيميا عمى ىالم األكاروز وتمثمت ب 2 بادئ أنتجت )26( حزمة متباينة من مجموع )26( حزمة, وقد تم تقسيميا إلى نوعين من الحزم حسب نمط التمييز: النوع األول : البادئات التي أظهرت حزما مميزة Unique :Bands بينت ىذه الد ارسة وجود 2 بادئا من ىذا النوع تمكنت من تشخيص :2 تركيبا و ارثي من الباميا, وبمغت نسبة ىذه البادئات و 83,3 من مجموع البادئات التي أظيرت نواتج تفاعل, وأنتج ىذا النوع من البادئات عدد من الحزم بمغ 21 حزمة وكان عدد الحزم المتباينة التي سجمتيا 21 حزمو بمغت نسبتيا 8, من مجموع الحزم المتباينة التي ظيرت في ىذه الد ارسة وشممت البادئات OPA18( و OPD2 و OPE16 و OPH1 و OPI2 OPI12 و OPJ13 و OPL2 و OPM8 OPN و OPQ6 OPP و و و OPQ2 ).واالشكال 2 و 3 و و 5 توضح نواتج تفاعل بعض البادئات المستخدمة, كما يبين الجدول )3( عدد الحزم الناتجة والمميزة والغائبة والكفاءة والقدرة التمييزية لكل بادئ. النوع الثاني من البادئات: ىي البادئات التي أظيرت حزما متباينة بين الت اركيب الو ارثية المدروسة إال أنيا لم تتمكن من تحديد تركيب و ارثي معين من بين الت اركيب األخرى وبمغ عددىا )6( بادئات وبمغت نسبتيا 38, من مجموع البادئات التي أظيرت نواتج تفاعل, وكان ليذه البادئات مجموع من الحزم بمغ )3( حزمة جميعيا متباينة األو ازن الجزيئية بمغت نسبتيا 3,8 من بين الحزم المتباينة الكمية, وان سبب تباين الحزم الناتجة يعود إلى اختالف المادة الو ارثية لكل تركيب و ارثي في ىذه الد ارسة وىي و OPA1( وOPV1 (. OPE1 وOPQ1 مناقشة نتائج تفاعالت ال : RAPD OPR6 و إن عدم الحصول عمى أي نواتج تضاعف عند استخدام البادئات (, OPP1 OPC5, OPB1, OPJ1, OPM2 )OPA6, OPQ1, OPN16, يمكن تفسيره بأن تمك البادئات لم تجد موقعا مكمال عمى المجين, وىذه الحالة شائعة, فقد وجد في د ارسات عدة أن ىناك نسبة من البادئات لم تظير نواتج تضاعف, واتفقت ىذه النتيجة مع )العاصي, )3113 و Rawashdeh( و )311 Amri
هجلت جبهعت تكريت للعلوم السراعيت ISSN1813166 21 / 3 / 226 و Aladele( وآخرون,311( وو Saifullah( وآخرون, 3121( و Nwangburuka( وآخرون,3122( وىذه البادئات ليا فائدة في الكشف عن مجموع ىذه الت اركيب الو ارثية, إذ إن أي تركيب و ارثي يظير ناتج تفاعل باستخدام ىذه البادئات يفسر بأن ىذه المادة الو ارثية التي أظيرت حزما ىي خارج إطار ىذه الت اركيب الو ارثية. أن وجود التباين بين الت اركيب الو ارثية لمباميا يرجع إما نتيجة غرس insertion قطعة كبيرة من ال DNA بين مواقع ارتباط البادئ مما يتجاوز قابمية ال, PCR والنتيجة فقدان في القطع, أو حذف deletion قطعة صغيرة من ال DNA مما يؤدي إلى تغيير في حجم القطع المتضاعفة أو حذف احد موقعي ارتباط البادئ ينتج عنو أما فقدان قطعة, أو زيادة في حجم القطعة المضاعفة أو استبدال نيوكميوتايدة ضمن احد أو كال موقعي ارتباط البادئ مما يؤدي إلى وجود أو غياب التباين أو إلى تغيير في حجم القطعة المضاعفة Weising( وآخرون, 3116 (. والجدول )3( يوضح عدد الحزم الناتجة والكفاءة والقدرة التمييزية لكل بادئ, اذ يتبين من الجدول ان جميع البادئات المستخدمة أظيرت حزم متباينة في الموقع والعدد والحجم, ومن بين تمك الحزم توجد ما يعرف بالحزم الفريدة التي ليا دور في تحديد البصمة الو ارثية لتركيب و ارثي معين )احد اآلباء أو اليجائن( دون باقي الت اركيب الو ارثية الداخمة في الد ارسة, فوجود الحزم الفريدة يوفر الجيد والوقت والتكمفة, ألنيا تعطي نتائج ذات ميزة عالية بوقت قياسي, وان وجود الحزم الفريدة ال يقل أىمية عن غياب حزمة رئيسة من صنف أو ىجين معين فيي أيضا ميمة في تحديد البصمة الو ارثية لذلك الصنف من بين األصناف الداخمة في الد ارسة, كما أن البادئات التي تؤدي نتائج تفاعالتيا إلى وجود حزما متباينة عدة تكون فرصتيا اكبر في أيجاد حزم فريدة لمت اركيب الو ارثية الداخمة في الد ارسة, مع بقاء الفرص سانحة بالنسبة إلى البادئات التي تنتج أعدادا قميمة من الحزم المتباينة Williams( وآخرون, 2:: ( غير أن ىذه الحزم الفريدة أو الغائبة قد ال تميز األصناف التي ظيرت بيا عن باقي األصناف عند زيادة عدد األصناف الداخمة في الد ارسة. وتشير نتائج الجدول )3( إلى أن ىناك بادئات امتازت نتائجيا بإف ارز عدد من األصناف واليجائن تميزت من خالل أكثر من بادئ كما ىو الحال لميجين التبادلي )2 6( إذ اظير مؤش ارت مع البادئات) OPM8 1222 و OPP و 15 OPQ2 1, 3 ) وكذلك اليجين التبادلي )5 ( مع البادئ ( 316 OPH1 3, ) واليجين التبادلي ) 8( مع البادئات) OPD2 12 و )OPN, أما األب 6 فقد اظير 5 حزم متميزة مع البادئ, OPL2, 5, مما يجعل ىذه الحزم تمثل الط ارزلؤلب والتي يعول عمييا في الكثير من د ارسات المقارنة والتشخيص وغيرىا, كما أنتجت بعض البادئات أكثر من حزمة متميزة مما أعطى ىذه البادئات فعالية كبرى في تمييز أكثر من تركيب و ارثي واحد بنفس الوقت متفوقة بذلك عمى البادئات التي أظيرت حزم متباينة كما في البادئ OPE16 الذي كانت لو القدرة عمى تمييز ت اركيب و ارثية, والبادئات) OPA 18 و OPI2 و OPI12 و OPJ13 و )OPQ6 التي كانت ليا القدرة عمى تمييز تركيبين و ارثيين لكل منيما, كما أن البادئان OPI2 و OPJ13 غابت فييما الحزمة العامة 11 و 811 عمى التوالي لميجين التبادلي. تقدير البعد الو ارثي باالعتماد عمى نتائج ال : RAPD استخدمت نتائج كافة البادئات بمجموعتييا األولى والثانية من نتائج تفاعالت مؤش ارت ال RAPDبيدف تقدير البعد الو ارثي بين الت اركيب الو ارثية المدروسة )اآلباء واليجائن التبادلية( وذلك عن طريق البرنامج الو ارثي )NTSYS_PC, )Version 1, المعد لذلك باستخدام الحاسوب و الذي يعتمد عمى وجود الحزم المشتركة بين كل تركيب و ارثي وكذلك الفريدة والغائبة ومعتمدا في تحميالتو عمى معادلة Nei ):2:8(, وتمثمت النتيجة بالجدول )( الذي يوضح قيم األبعاد الو ارثية التي ت اروحت بين )1.28( و )8:.1(, ففي حالة تتطابق المادة الو ارثية بين تركيبين و ارثيين فيذا يدل عمى أن البعد الو ارثي بينيما يجب أن يكون مساويا لمصفر, أما نسبة التشابو الو ارثي فتكون مساوية ل 2) 211( Essleman( وآخرون, 3 ( والتطابق ىنا يحدث عند عدم وجود تباين و ارثي بين األصناف باستخدام عدد من البادئات, لكن عند استخدام عدد أكثر من البادئات أو استخدام مؤشر و ارثي آخر قد تختمف النتيجة وذلك الختالف مناطق االرتباط حسب تسمسل البادئ المستخدم, واستنادا إلى نتائج البعد الو ارثي, فقد تم استخ ارج التحميل التجميعي المتمثل بالشكل )6( لكافة الت اركيب الو ارثية قيد الد ارسة وذلك إلظيار العالقات الو ارثية التي تربط اآلباء مع اليجائن التبادلية لمباميا وتوزيعيا بشكل مجاميع. إن الذي يحدد القرب أو البعد الو ارثي بين األصناف ىو عدد الحزم المشتركة فكمما كثر عدد تمك الحزم قل البعد الو ارثي والعكس صحيح, فتمك الحزم المشتركة تدل عمى تشابو في المادة الو ارثية في تمك المنطقة من المجين لؤلصناف المدروسة الذي قد يمثل تشابيا في الصفات المظيرية وخصوصا الثمار أو في صفات أخرى تتعمق باإلنتاجية والتكاثر والمقاومة لؤلم ارض أو التشابو في التكيف الو ارثي لممتطمبات البيئية المالئمة لمنمو واإلنتاج أو غير ذلك من الصفات الكثيرة أو قد يكون التشابو في منطقة
هجلت جبهعت تكريت للعلوم السراعيت ISSN1813166 21 / 3 / 226 من المناطق غير المشفرة التي ليس ليا تعبير جيني وتعرف ب, Non_coding DNA أما األصناف البعيدة و ارثيا عن بعضيا فيي التي تشترك بأقل عدد من الحزم مع بعضيا وذلك لوجود اختالفات في تسمسل النيكميوتيدات في المجين لتمك األصناف ويتضح ىنا دور استخدام بادئات مختمفة تستيدف عدة مناطق من المجين, وبذلك يظير االختالف إن وجد بين األصناف المدروسة حسب تسمسل البادئ ودرجة االختالف بين مجينات األصناف المدروسة, ياسين. )311( إن ظيور الت اركيب الو ارثية لمباميا في ىذه الد ارسة بيذا الترتيب اعتمادا عمى نتائج مؤش ارت ال RAPD جاءت متوافقة مع االنحدار ليذه الت اركيب الو ارثية بشكل عام كون إن اغمب ىذه الت اركيب اشترك بأكثر من أب في استنباطيا باإلضافة إلى إن الظروف البيئية المحيطة بأغمب مناطق ز ارعة ىذه الت اركيب تكاد تكون متماثمة مما يؤثر في طبيعة تصفية خطوطيا من قبل المربي والذي سينتخب من ىو مالئم ليذه البيئة, لذا فان بناء شجرة النسب Phylogenetic أو ما يسمى بالتحميل التجميعي المعتمد عمى قيم األبعاد الو ارثية لو ما ي س وغو في كافة الد ارسات التي تتوخى استنباط صنف جديد أو تحسين إنتاجو مع تقميص الفترة الالزمة لذلك في آن واحد, ألن ذلك يظير التباين الو ارثي بين اآلباء كخطوة أولى من ثم مقارنة األف ارد الناتجة باآلباء في عمميات التربية والتحسين, وبيذا يكون االستثمار األمثل لمثل ىذه المؤش ارت من خالل األخذ بنظر االعتبار جميع نتائج البادئات التي استخدمت من ىذه الد ارسة حتى تمك التي لم تظير نواتج عمى اليالم )المجموعة األولى( كونيا تستخدم الستبعاد أي صنف من الباميا ال ينتمي إلى ىذه المجموعة من األصناف التي أدخمت لمد ارسة ومن ثم حذف أي صنف يظير حزما متباينة مع البادئات التي أظيرت أصناف الباميا المدروسة حزما متماثمة معيا. لقد بينت نتائج التحميل التجميعي لمت اركيب الو ارثية المدروسة لنبات الباميا وكما موضحة في الجدول )( والشكل )6( أن اآلباء 2 و 3 و و 5 وقعوا ضمن مجموعة واحدة وكانت قريبة و ارثيا, كما أظير التحميل التجميعي أن األب )6( ىو األب الوحيد الذي ابتعد في تصنيفو الو ارثي عن باقي اآلباء قيد الد ارسة, ويتضح ذلك من مالحظة المخطط التجميعي في الشكل )6( وقد أعطى أعمى القيم لمبعد الو ارثي عن باقي اآلباء وكما ىو مبين في الجدول )(, وان طبيعة وصفو الظاىري عزز ىذا التصنيف الو ارثي فكان ىذا التركيب مختمفا تماما عن كل اآلباء المدروسة وبيذا يمكن االستفادة منو الدخالو في ب ارمج التربية النتاج ىجن تتميز بقوة ىجين عالية.
21 / 3 / 226 هجلت جبهعت تكريت للعلوم السراعيت ISSN1813166 هواقع االرتببط الوواقع الوتببينت الجدول رقم )3( نواتج التضاعف والقطع المتماثلة والمتباينة لبادئات مؤشر ال RAPD الوواقع الوتوبثلت هذى الوزى الجسيئي للوواقعbp الكفبءة القذرة التوييسيت الوزى الجسيئي للحسم الوويسة bp الظبهرة الغبئبت 8 11 11 5 316 3 11 11 8 5 1122 12 1161 12 6 1 3 التراكيب الوراثيت الوويسة 2 3 21 1 6 3 63 6 56 63 5 51 3 65 61 51 2 51 511 616 616 1 513 616 1 511 1 511 11 11 11 8115 513 511 616 616 1 513 616 1 511 1 511 11 11 11 8115 513 612 12 311 12 312 51531 132 381 81531 3138 12 11 312 313 31318 31 1 8 6 6 15 1 1 11 8 1 8 6 6 15 1 1 11 8 اسن الببدئ OPA18 OPA1 OPD2 OPE1 OPE16 OPH1 OPI2 OPI12 OPJ13 OPL2 OPM8 OPN OPP OPQ6 OPQ1 OPQ2 OPR6 OPV1
21 / 3 / 226 هجلت جبهعت تكريت للعلوم السراعيت ISSN1813166 accessions by DNA markers, Journal of Biotechnology. 2(3) : 551. Maniatis, T.; E.F. Fritsch; and J. Sambrook (21).In Vitro application of DNA by the polymerase Chain Reaction, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2 nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, p.61. Nei, M. and W.H. Li (1). Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proceeding of the National Academy of Science, USA., 526523. C. F. by Henry, R.J. (1). Nwangburuka, C. C.; O. B. Kehinde; D. K. Ojo; A. R. Popoola; O. Oduwaye; O. A. Denton and M. Adekoya (211). Molecular characterization of Twentynine Okra Accessions using the random amplified polymorphic DNA (RAPD) molecular marker J. of L. and Ph. Sci.ac. Satech, (1): 11. Prakash, K. M. P. and K.V. Ravishankar (211). Assessment of genetic relatedness among okra genotypes (Abelmoschus esculentus L. Moench) using RAPD markers. Electronic Journal of Plant Breeding, 2(1):886. Rawashdeh, I. and A. Amri, (26).Genetic characterization varieties using RAPD markers. Jordan of Agri. Sci. 2(3):2322. Rohlf, F.J.(13) Numerical taxonomy and multivariate analysis system. Version 1.8 Exeter software. Setauket. N. Y. Saghai Maroof, M. A.; K. M. Soliman, R. A. Jorgensen, and R. W. Allard (18). Ribosomal DNA spacer length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and population dynamics Proc. Natl. Acad. Sci, USA. 81: 81818 Saifullah M.; M.G. Rabbani and E. J. Garvey(21).Estimation of genetic diversity of okra (Abelmoschus esculentus المصادر مطموب عدنان ناصر وعز الدين سمطان محمد و كريم صالح عبدول ): 2: (.إنتاج الخض اروات الجزء الثاني)الطبعة المنقحة( جامعة الموصلو ازرة التعميم العالي والبحث العممي. الع ارق. المنظمة العربية لمتنمية الز ارعية )3122(. جامعة الدول العربية, الكتاب السنوي لالحصاءات الز ارعية المجمد )2(. ياسين, معن حسن صالح )3122(. تحديد التباين الو ارثي لعدد من أصناف نخيل التمر في الع ارق باستخدام مؤش ارت RAPD وISSR. رسالة ماجستير, كمية العموم/جامعة تكريت. الع ارق. العاصي, عقيل حسين عمي )3113(. استخدام مؤش ارت ألدنا في تحميل التنوع الو ارثي لمشعير ).L )Hordeumvulgare المزروع في العر اق. اطروحة دكتو اره. كمية التربية/ابن الييثم جامعة بغداد. الع ارق. Aladele, S. E. ; O. J. Ariyo and R. de Lapena (28). Genetic relationships among West African okra (Abelmoschus caillei) and Asian genotypes (Abelmoschus esculentus) using RAPD. African J. of Biotechnology, (1): 126131. Esselman, E. J. D. J., Crawford, S. Brauner, T. F. Stuessy, G. J. Anderson, and Mariosilva, O. (2). RAPD markers diversity within and divergence among species of Dendroseris (Asteraceae : lactuceae). Am. J. Bot. 8: 516. Grudman, H; C. Schneider, D; Hartung, F. D; Daschner, and T. L; Pith (15). Discriminatory power of three DNA typing techniques for plant aeruginosn. J. clin. Microbiol. 3: 528532. Kumar, G. M. P; and T. V. Ananthanarayanan (21). Molecular fingerprinting of okra
21 / 3 / 226 Williams, J.G.K; A.R., KubelikK.J.,, Livak, J.A. Rafalski, and S.V. Tingey, (1). DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucl. Acids Rese. 18: 65316535. Williams, C. E. and D. A. StClair, (13).Phenetic relationships and level of variability detected by restriction fragment length polymorphism and random amplified DNA analysis of cultivated and wild accessions of Lycopersicanesculentum. Genome. 36: 6163. هجلت جبهعت تكريت للعلوم السراعيت ISSN1813166 L. Moench) using RAPD markers SAARC. J. Agri., 8(2) : 128. Weigand, F.; Baum, M. and Udupa, S. (13). DNA molecular marker techniques, technical manual. No.2. International Center for Agricultural Research in the Dry Areas. Aleppo, Syria. Weising, K. ; H. Nybom; K. Wolff, and G. Kahl, (25). DNA fingerprinting in plants Principles, Methods, and Applications 2 nd Edition. Taylor & Francis Group.